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Anthony Mackie nació en Nueva Orleans (Louisiana) y asistió al New Orleans Center for Creative Arts (NOCCA). Se graduó en el programa de teatro del Instituto de Arte de Carolina del Norte y, más tarde, en la Juilliard School.

Su primer papel como protagonista fue en la película independiente Brother to Brother (2004), donde interpretó a un joven artista afroamericano que lucha por adaptarse al mundo como un homosexual. También hizo su aparición como Papa Doc en la película protagonizada por el rapero americano Eminem 8 millas (2008).

Mackie demostró su versatilidad con sus siguientes trabajos: un drama titulado El mensajero del miedo (2004), la comedia She Hate Me (2004), en Million Dollar Baby (2004), en la cinta de acción El jefe (2005) y en Equipo Marshall (2006), una película del género deportivo.

Quizá su personaje más destacado y aclamado fue el del sargento J. T. Sanborn en el film En tierra hostil, de la directora Kathryn Bigelow, para muchos críticos de Hollywood la mejor película de 2009. La cinta estuvo nominada en tres categorías en los Globos de Oro 2010: Mejor Director, Mejor Película y Mejor Fotografía.

Otros títulos de la filmografía de Mackie son: La conspiración del pánico (2008) del director D. J. Caruso, Flor del desierto (2009) y Night Catches Us (2010).